行业研究

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｜中肽生化内容团队编辑

摘要：双环肽已崭露头角，成为受限肽家族中的重要驱动力。它综合了小分子药物和生物制品的优势，其高度受限的分子结构被认为具有类似抗体的靶向结合性能。在过去五年里，双环肽领域取得了显著的进展，不仅在水生生物中发现了新的双环肽次生代谢产物，而且成功地从头合成了多种不同的双环肽，拓展了新的化学骨架。

肽类药物在追求安全有效的药物中至关重要，这一点已经被不断增多的获批肽类药物所证明。通过将生物制剂的效力和选择性与小分子的化学可及性相结合，肽类药物有望弥合制药领域最成功的两类药物之间的差距。由于传统肽类药物的共同挑战，比如有限的稳定性和生物利用度，化学修饰以制备更符合药物标准的分子被证明是至关重要的。例如，天然产物环孢霉素的临床成功就表明了这些修饰的重要性，其中包括非规范的氨基酸、部分N-甲基化的骨架、反转的立体中心以及大环化限制结构。约束肽的临床潜力使它们成为肽研究的焦点，包括对诸如大环化、肽稳定化和多环化等技术的探索。

双环肽已经成为约束肽家族中被高度关注的一个分支。近年来，与之相关的科学文献层出不穷 (图1）。与单环肽相比，双环化增强了结构的刚性，提高了代谢稳定性，增加了靶点亲和力。双环肽的结合特性被比作抗体的结合特性，其结构使它们特别适合破坏蛋白质间的相互作用。由于具有两个大环结构，两个环都可以与预期的靶标结构形成联系，或者与两个不同的靶标结合。因此，双环肽通常被设计为抗微生物或抗癌药物，使它们成为下一代制药研究中引人注目的分子类别。

图1. 1991年至2021年有关双环肽及其引用的科学文献。发表和引文数据分别来自PubMed和Web

of Science。所有具有两个大环结构的肽通常被视为双环肽。通常，这个术语指的是包含两个循环的肽，这些循环是由在肽序列内部的三个点锚定的支架所产生的（图2a）。含有内部桥梁的大环肽也属于双环肽（图2b）；这种类型在自然界中也存在（图3）。偶尔，双环定型（图2c）和双大环肽（图2d）也被称为双环肽。所有这些双环拓扑结构都是深入研究的对象，包括探索新的合成途径以获得它们。

图2. 双环肽拓扑结构的简化表示。(a)在肽的三个接触点上拴着的环 (b)具有内部桥的肽大环。(c)双钉肽。(d)双大环肽

图3 天然双环肽的化学结构。(一) α鹅膏蕈碱 (b)

SFTI-1[36] (c) Theonellamide K (d)酰胺C天然存在的双环肽许多多肽衍生的天然产物是环状的，其中一些像万古霉素或环孢霉素已成功应用于临床。近五年，大概报告了十种新的天然双环产物，其中，关于双环肽天然产物α-氨替酮和SFTI-1（图3a，b）进展较快。α-氨替酮和費洛定等氨基酸融合的双环肽是鬼伞菇（Amanita phalloides）的毒性成分，负责其毒性。2018年，Perrin及其同事首次报告了α-氨替酮（图3a）的全合成。SFTI-1是一种头对尾的环肽，具有二硫键，可以抑制丝氨酸蛋白酶肝素，其抑制常数小于亚纳摩尔（图3b）。它已经成为广泛研究的对象，包括作为蛋白酶抑制剂的平台或作为分子嫁接支架。Craik及其同事研究了后者，通过将已知的四肽药效团引入双环SFTI-1，创造出黑色素皮质激素的强效配体。瑞尼拉属（Theonella）海绵中的希斯蒂地氨基酸融合的双环肽和奥帕洛艾胺是来自Theonella属的希斯蒂地氨基酸融合的双环肽。最近，在瑞尼拉希氏（Theonella swinhoei）中发现了瑞尼拉胺J和K（图3c），以及5-顺-α-帕奥帕洛艾胺。类似于它们的结构亲属，瑞尼拉胺J和K表现出细胞毒性。Nyuzenamides A-C发现在水生链霉菌属的细菌中。从多孔动物门中采样的海洋Bacillus safensis中分离出Seongsanamides A-D。这七种双环肽在它们的支架结构上结构相似，因为两种类型都属于具有额外异二酪氨酸连接的环脱肽肽分类。Nyuzenamide A和B表现出细胞毒性和抗真菌活，而含肉桂酸的nyuzenamide C（图3d）在细胞培养实验中表现出抗血管生成特。双组分分子间双环化经常使用的一种生成双环肽的试剂是1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)。在噬菌体蛋白质上使用TBMB标记是通过遗传编码的双环肽库的一个重大突破(Scheme 1，图4a)。与成熟的噬菌体展示平台结合使用，意味着可以通过迭代选择快速确定生物活性的双环肽，提供了一种较低分子量的抗体和其他结合蛋白的替代方法。然而，试剂过量可能导致线性肽的非特异性修饰。这一技术后来通过开发具有类似对称性和硫醇反应性的额外试剂而得以改进，例如1,3,5-三丙烯酰胺-1,3,5-三嗪(TATA)、N,N′,N′′-(苯-1,3,5-三基)三(丙-2-烯酰胺) (TAAB)和N,N′,N′′-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酰胺) (TBAB)。

Scheme 1 含三个半胱氨酸的肽的TBMB双环化

图4. 双组分分子间反应合成的选定双环肽的化学结构。(a)被TBMB双环化的肽[66](方案1)。(b)由pd催化s-芳基化[53]合成的双环肽(方案3)。(c)肽-铋双环[55](方案4)。(d)具有融合双四氢三嗪键的双环肽

另外，也有从三胱氨酸基序出发制备双环肽的替代策略。与TBMB烷基化类似，这些反应通常利用了半胱氨酸的独特亲核性质。Pentelute及其合作者之前开发了一种基于全氟芳基连接子的多肽钉接策略.为了合成双环肽，该研究组改进了这一技术，以连接三个半胱氨酸残基（见Scheme 2）。

Scheme 2. 利用DFBP和BTT对含有三个半胱氨酸的多肽进行双环化

使用过量的十氟代联苯（DFBP）作为初始试剂，将三个半胱氨酸侧链中的每一个进行单取代反应。随后，将苯-1,3,5-三硫醇（BTT）添加到经过修饰的肽中，以进行第二次亲核芳基取代反应，形成双环肽（Scheme 2）。如果两个半胱氨酸使用StBu进行正交保护，那么四个半胱氨酸可以生成双环肽（图2c）。这些双环肽包含富含精氨酸序列，旨在将寡核苷酸递送至哺乳动物细胞。正交偶极炔点击化学方法被用于连接肽和寡核苷酸。金属催化的S-芳基化方法仅需要一次反应来使三半胱氨酸肽成环。Stauber等人开发了多种Au(III)配合物，不仅限于成环，还适用于介导多位点的生物共轭反应和肽环化。双环肽是在中性缓冲液和乙腈混合物中生成的，其中各种Au(III)配合物的中心支架被转移到线性肽的三个半胱氨酸上（Scheme 3）。随后，Mudd等人通过引入更小支架的Au(III)配合物进一步扩展了这项工作（Scheme 3）。此前，Chen及其合作者已找到另一种有效创建类似的双环肽的途径，使用钯催化的S-芳基化反应和三碘芳烃（Scheme 3，图4b）。

Scheme 3. 利用金(III)配合物或三碘芳烃的s -芳基化和钯催化进行肽双环化

三硫氨酸肽和三价铋也可以生成双环肽。当在生理pH下处于还原条件下，与BiBr3（溶于DMSO）接触时，线性肽前体会形成双环结构（见scheme 4, 示意图4c）。该反应允许原位获得具有药物发现兴趣的双环肽，正如通过带有寨卓卡病毒和西尼罗河病毒NS2B-NS3蛋白酶识别基序的纳摩尔抑制剂所证明的那样。

Scheme 4生物相容性条件下肽铋环的生成

Chen及其同事开发了一种利用赖氨酸和精氨酸残基进行双环化的反应。该方法基于一种使用甲醛连接氨基酸的订书钉策略。通过使用胺、甲醛和胍，制备了多环肽拓扑结构。通过添加甲醛，对带有两个赖氨酸和一个精氨酸残基的肽进行了双环化（scheme 5a，图4d）。或者，精氨酸侧链可以被赖氨酸残基和胍所取代，形成了三个赖氨酸之间的连接（scheme 5b）。然而，这种双环化中碱性氨基酸的参与限制了具有标准氨基酸的可能双环肽的序列空间。

Scheme 5四氢三嗪键融合双环肽的合成

预安装反应把手,用于分子内双环化设计分子内双环化反应方面，将反应性的功能团作为线性肽链的一部分安装，而不是将外部试剂应用于组装后的线性肽。Reymond及其合作者将3,5-双(氯甲基)-4-甲基苯甲酸与肽N-末端耦合，随后形成了与半胱氨酸的两个硫醚键 (scheme 6，图5a）。利用这一策略，合成了对多药耐药的巴克特气单胞菌（Acinetobacter baumannii）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas

aeruginosa）具有活性的双环抗菌肽。

Scheme 6. N端3,5-二(氯甲基)-4-甲基苯甲酸合成双环肽

图 5. 通过预先安装的反应手柄生成的选定双环肽的化学结构。(a) n端引入3,5-双(氯甲基)-4-甲基苯甲酸反应后的双环肽（scheme 6) ; (b) 2,6-二氰吡啶与两个1,2-氨基巯基反应形成肽链(scheme 8)

通过SPPS合成具有两个羧酸的氨基酸也可以实现双环化（scheme 7）。一种光反应允许将两个3-巯基丙酸分子添加到丙炔基甘氨酸上。肽中两个胺的正交脱保护使选择性的内酰胺偶联成为可能。通过这种方式合成的双靶向α-螺旋自行车显示出潜力作为抗癌细胞毒素。

Scheme 7用原位生成的二羧酸氨基酸合成双环肽

一个替代的肽二环化方法基于2,6-二氰吡啶与1,2-氨基硫醇的反应。这两个功能基团被整合到了与SPPS兼容的非天然氨基酸中，这些氨基酸可以在线性肽的合成之前或期间组装。N-末端的半胱氨酸也可以用作1,2-氨基硫醇反应物之一，以前已经用于侧链到尾部的大环化反应的研究。值得注意的是，这个反应与非N-末端的半胱氨酸是正交的。在SPPS期间肽的组装和从固体支持上切割后，当暴露在生理pH值下的还原缓冲液中时，线性肽会自发地二环化。与导致类似拓扑结构的先前策略相比，这种方法提供了易于获得芳香核心骨架。这种技术被用来制备寨卡病毒蛋白酶的抑制剂和α-螺旋肽奥雷因1.2的双环形式。

Scheme 8. 利用2,6-二氰吡啶和1,2-氨基硫醇残基在SPPS过程中结合成线性肽的反应性合成双环肽环化的进一步修饰在某些情况下，N-末端的独特化学性质被用作便捷的反应手柄以实现选择性。借助N-末端丝氨酸的1,2-氨基醇的反应性，Derda及其合作者安装了醛和巯基反应性的偶氮苯基基团（HADCAz），从而实现了分子内环化（Scheme 9）。最初，N-末端丝氨酸通过碘酸钠氧化为丙二酰胺。然后，使用肟键合反应将HADCAz连接到N-末端。最后，在略带碱性和还原条件下，肽中的两个半胱氨酸残基与HADCAz的1,3-双(氯甲基)苯基团（BCMB）之间发生了双硫醚的钉扣反应，形成了双环肽。由此产生的环肽通过HADCAz的偶氮基团表现出光切换性能，当受紫外光源（λ = 365 nm）照射时，E形式可逆转为Z形式。与其他光诱导偶氮苯基夹具类似，这种异构化使肽发生显著的构象变化，从而为光药理学研究提供了潜在应用。

Scheme 9. 通过HADCAz连接的光响应双环肽的合成

在大环中通过内部交联实现双环化

由于天然的双环肽经常包括内部的交叉连接，因此这种拓扑结构长期以来一直是化学合成的主要目标。最近有许多关于大环肽内的桥接的例子（图6）

图6 桥联双环肽的拓扑结构

其中包括已在环状肽内生成的Phe-Phe、Phe-Tyr和Tyr-Tyr类似的双芳基连接（图6a和7a）。合成可以根据特定的连接进行定制，但通常需要微波辅助Suzuki-Miyaura交叉偶联条件。

图 7 选定桥接双环肽的化学结构。(a) Phe-Phe二芳基连接双环肽(图6a) (b) opa双环化肽（SCHEME 10)

化学家们分别基于半胱氨酸和异喹啉的连接发表了双环肽的合成（图6c和7b）。同时探索了邻苯二醛（OPA）作为肽链含有赖氨酸和半胱氨酸残基的肽的宏环和双环化试剂的反应性，通过此方法，通过原生化学连接合成的环肽进行了交联，从而制备了双环肽（方案10）。也有研究中使用了大环内酯化的肽（scheme 10）。使用各种OPA类似物，他们能够创造多种具有不同荧光特性的双环肽，包括α-毒鸟苷衍生物。

Scheme 10 初始大环化后与OPA的肽双环化

关于双环肽疗法大多数双环肽的设计旨在用于抗微生物或抗癌应用，这也适用于目前正在临床试验中的双环肽。双环肽-毒素共轭物BT1718、BT5528（图8）和BT8009正在进行I/II期临床试验，作为抗癌药物进行评估。双环肽-毒素共轭物的概念与抗体-药物共轭物相关，其中抗体被双环肽配体取代。这项技术利用了多肽展示能够可靠产生几乎任何蛋白质靶标的双环配体，包括肿瘤中过表达的靶标。鉴于这些双环肽的独特特性，双环-毒素共轭物表现出与抗体-毒素共轭物不同的有前途的药理特性。双环肽配体的应用为开发靶向癌症治疗提供了新的机会。未来几年内，双环肽还可能成为传递治疗性RNA或放射性同位素的选项。

图8 双环肽-毒素偶联物BT5528的化学结构，由塔塔连接肽链BCY6099、分子间隔物、组织蛋白酶-可切割连接物和细胞毒素MMAE组成

科学界一直密切关注PCSK9抑制大环肽的进展。MK-0616，其化学结构在2023年初被揭示（图9c），目前正在进行II期临床试验。这种口服可用的抑制剂已经在高胆固醇血症方面显示出了有望的结果。一种mRNA展示的肽文库被约束于BBMB中，并被选择用于结合PCSK9。两种宏环肽被鉴定为抑制物，抑制了PCSK9与LDLR的关键蛋白质相互作用。通过广泛的结构引导设计，较不活跃的抑制物（Ki≈1μM）被转化为一个具有近1000倍改善活性的双环肽引物（Ki≈1nM，图9a，b）。引物结构在其药理参数方面进一步优化，引入了额外的钉子，形成了一种口服可用的三环肽，其活性提高了超过500倍（Ki≈2pM）。随后的结构变化旨在提高药物的稳定性和溶解度，最终产生了三环肽MK-0616（Ki≈5pM，图9c）。这一系列抑制剂的开发标志着迈出了一步有意义的步伐，突显了多环肽在医学中的巨大潜力。

图 9 靶向PCSK9的大环肽。(a)初始双环肽导联的化学结构。(b)结合LDLR结合位点(PDB: 6XIE)的PCSK9(绿色)和双环肽抑制剂(紫色)的x射线共晶结构。(c)临床候选三环肽MK-0616的化学结构。

参考文献：

1.Bicyclic peptides: Paving the road for therapeutics of the

future，Pept

Sci.2023;1–15.

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